Marine Pseudoalteromonas species are associated with higher organisms and produce biologically active extracellular agents

Abstract

The newly established genus Pseudoalteromonas contains numerous marine species which synthesize biologically active molecules. Produkcja szeregu związków aktywnych przeciwko różnym organizmom docelowym wydaje się być unikalną cechą tego rodzaju i może znacznie przynieść korzyści komórkom Pseudoalteromonas w ich konkurencji o składniki odżywcze i kolonizacji powierzchni. Gatunki Pseudoalteromonas są zwykle spotykane w połączeniu z morskimi eukariotami i wykazują działanie antybakteryjne, bakteriolityczne, agarolityczne i algobójcze. Co więcej, kilka izolatów Pseudoalteromonas szczególnie zapobiega osadzaniu się pospolitych organizmów zanieczyszczających. Podczas gdy wytwarzana jest szeroka gama hamujących czynników pozakomórkowych, znaleziono również związki sprzyjające przetrwaniu innych organizmów morskich żyjących w pobliżu gatunków Pseudoalteromonas.

1 Wprowadzenie

bakterie łatwo izolowane z wód morskich są heterotroficznymi bakteriami Gram-ujemnymi, wiotkimi i można je podzielić na dwie podgrupy w zależności od ich zdolności do fermentacji węglowodanów. W ramach grupy niefermentacyjnej rodzaj oznaczony Alteromonas został zmieniony na podstawie porównań filogenetycznych przeprowadzonych przez Gauthiera et al. w 1995 roku. Ich rewizja sugerowała, że rodzaj Alteromonas należy podzielić na dwa rodzaje, Alteromonas (który obecnie obejmuje tylko jeden gatunek) i nowy rodzaj, Pseudoalteromonas (Fig. 1 przedstawia drzewo filogenetyczne różnych gatunków przypisanych obecnie do rodzaju Pseudoalteromonas). Ten nowo utworzony rodzaj cieszył się dużym zainteresowaniem z dwóch powodów. Po pierwsze, gatunki Pseudoalteromonas są często spotykane w związku z eukariotycznymi nosicielami w środowisku morskim, a badania takich związków wyjaśnią mechanizmy ważne w interakcjach mikroorganizmów z gospodarzem. Po drugie, wiele gatunków produkuje biologicznie aktywne metabolity, które atakują szereg organizmów. Różne zewnątrzkomórkowe aktywności biologiczne wykazywane przez Gatunki Pseudoalteromonas są wymienione w tabeli 1. Celem tego przeglądu jest podsumowanie niektórych pojawiających się informacji dotyczących rodzaju Pseudoalteromonas i podkreślenie znaczenia ekologicznego i zakresu biologicznie aktywnych związków, które są wyrażone przez wiele gatunków członkowskich.

2 Izolacja gatunków Pseudoalteromonas

w klasyfikacji bakterii nie ma zastosowania wyraźne rozróżnienie między zwierzętami i roślinami morskimi i innymi niż morskie . Obecnie przedstawiciele większości kulturowych rodzajów bakterii mogą być izolowani zarówno ze środowiska lądowego, jak i morskiego. Jednak obecnie ustalono, że rodzaj Pseudoalteromonas zawiera gatunki, które pochodzą wyłącznie z wód morskich i że członkowie zostali wyizolowani z miejsc morskich na całym świecie . Co ciekawe, większość gatunków Pseudoalteromonas wydaje się być związana z eukariotycznymi nosicielami. Gatunki zostały wyizolowane z różnych zwierząt, takich jak małże , maskonury , osłonice i gąbki , a także z szeregu roślin morskich . Ich istnienie w różnych siedliskach i ich rozprzestrzenianie się na całym świecie sugerują, że strategie adaptacyjne i przetrwania wyrażone przez Gatunki Pseudoalteromonas są zróżnicowane, skuteczne i cieszą się dużym zainteresowaniem zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych.

3 aktywność biologiczna wyrażona przez Gatunki Pseudoalteromonas i Alteromonas

w ostatnich latach uzyskano wiele nowych informacji na temat produkcji biologicznie aktywnych metabolitów przez członków rodzaju Pseudoalteromonas i interakcji tych bakterii z różnymi organizmami gospodarza. W szczególności wykazano, że wiele gatunków Pseudoalteromonas wytwarza produkty antybakteryjne, które wydają się pomagać im w kolonizacji powierzchni, w tym powierzchni ich gospodarzy. Wytwarzanie agaraz, toksyn, substancji bakteriolitycznych i innych enzymów przez wiele gatunków Pseudoalteromonas może pomóc komórkom bakteryjnym w ich konkurencji o składniki odżywcze i przestrzeń, a także w ich ochronie przed drapieżnikami wypasanymi na powierzchniach. Ekologia bakterii na powierzchniach stałych jest złożona i wiele dodatkowych czynników oprócz produkcji metabolitów wtórnych i innych wydzielanych produktów wpływa na reakcje bakterii. Na przykład Ivanova et al. wykazano, że stopień hydrofobowości podłoża wpływa na wytwarzanie metabolitów antybakteryjnych. Największą aktywność antybakteryjną stwierdzono na powierzchniach hydrofilowych pomimo faktu, że przyłączone komórki Pseudoalteromonas były bardziej obfite na powierzchniach hydrofobowych . To odkrycie może sugerować, że ekspresja aktywności antybakteryjnej może być włączana i wyłączana w zależności od fluktuacji i bodźców obecnych w bezpośrednim otoczeniu komórki.

3. 1 działanie przeciwbakteryjne

gatunki Pseudoalteromonas wykazują szeroki zakres działania antybiotycznego. Wykazano, że trzy gatunki, P. aurantia, P. luteoviolacea i P. rubra, wytwarzają związki antybakteryjne o dużej masie cząsteczkowej . Aktywność antybakteryjna wykazywana przez różne szczepy P. luteoviolacea jest szczególnie interesująca i sugerowano, że wynika z dwóch klas związków. Po pierwsze, polianionowe makrocząsteczki związane z komórkami, które są częściowo dyfuzyjne w pożywkach hodowlanych, uważano za kwaśne polisacharydy. Późniejsze badania McCarthy et al. wykazano, że te wysokocząsteczkowe związki są związane z białkami . Druga grupa antybiotyków wytwarzanych przez P. luteoviolaceus zawiera małe związki bromowane, które są związane komórkami i nie dyfuzyjne do mediów. Wiadomo, że te związki bromowane mają silne działanie bakteriobójcze . W produkcji różnych antybiotyków wykazano heterogeniczność różnych szczepów P. luteoviolaceus. Stwierdzono, że różne szczepy syntetyzują cząsteczkę polisacharydu lub małe bromowane metabolity, lub oba. Te różnice w produkcji środków przeciwbakteryjnych mogą sugerować, że szczepy P. luteoviolaceus pierwotnie wybierały różne organizmy lub siedliska gospodarza i z czasem ewoluowały oddzielnie, aby wytworzyć rozbieżne związki. Samo hamowanie obserwowano również u pacjentów z P. komórki luteoviolaceus i sugeruje się, że pośredniczy w makrocząsteczkowym związku antybiotykowym . Wykazano również, że te polianionowe węglowodany są ważne w przywiązywaniu bakterii do powierzchni stałych , umożliwiając bakteriom wysoką konkurencyjność w kolonizacji organizmów gospodarza . Chociaż obserwuje się automatyczne hamowanie u gatunków Pseudoalteromonas, wykazaliśmy, że nie jest to zjawisko powszechnie występujące u innych bakterii morskich . Znaczenie tej aktywności w ekosystemie morskim zostało zakwestionowane, biorąc pod uwagę, że rozcieńczenie związków w fazie wodnej prawdopodobnie utrzymuje stężenie związków zewnątrzkomórkowych na niskim poziomie w pobliżu komórek . Jednak jest możliwe, że produkcja związków Auto-hamujących w populacji bakterii jest ważna dla utrzymania różnorodności mikrobiologicznej w obrębie mikrohabitatu . Biorąc pod uwagę ostatnie odkrycia, że zewnątrzkomórkowe związki autoindukcyjne są ważne w wielu populacjach bakterii, można również przewidzieć rolę cząsteczek autoindukcyjnych.

wykazano również aktywność antybiotyków za pośrednictwem polianionowej cząsteczki antybiotyku dla gatunku P. citrea. Stwierdzono, że te wielowartościowe aniony, które również pośredniczą w antybiotykowej aktywności P. rubra i P. luteoviolacea, hamują oddychanie bakterii . Co ciekawe, wykazano, że produkcja takich związków u kilku gatunków Pseudoalteromonas była zależna od mediów. Komórki nie wykazywały żadnej aktywności antybakteryjnej, gdy były hodowane na pożywkach zawierających krew, a ekspresja związków aktywnych była bardzo niska, gdy były hodowane na pożywkach agarowych i tryptycznych agarach sojowych zawierających sól . Biorąc pod uwagę, że dla bakterii mogą być potrzebne specyficzne warunki odżywcze do ekspresji ich zewnątrzkomórkowych związków biologicznie czynnych, sugeruje się, że niektóre związki bakterii-gospodarza w środowiskach morskich są kontrolowane przez dostępne źródła pożywienia.

3.2 zewnątrzkomórkowe enzymy i toksyny

Agar jest polisacharydem obecnym w ścianach komórkowych niektórych czerwonych alg. Wydaje się, że bakteryjna degradacja agaru zachodzi za pomocą dwóch mechanizmów opartych na swoistości enzymów β-agarazy i α-agarazy. Rozszczepienie łańcuchów polisacharydowych powoduje zmiękczenie agaru, dzięki czemu aktywność agarazy wyrażona przez bakterie żyjące w połączeniu z czerwonymi glonami może pomóc bakteriom w łatwym pozyskiwaniu składników odżywczych z glonów, tak jak ma to miejsce w przypadku bakteryjnej degradacji liści zielonych i brązowych alg . Vera et al. zidentyfikował izolat agarolityczny, szczep P. antarctica N-1 i scharakteryzował wytwarzaną z zewnątrz agarazę jako endo β-agarazę I. Inne szczepy rozkładające agarazę w obrębie rodzaju Pseudoalteromonas to P. agarolyticus, P. Sp. szczep C-1, p. carragenovora, P. atlantica i P. citrea. Stwierdzono, że większość zgłaszanych szczepów Agarolitycznych Pseudoalteromonas wytwarza zewnątrzkomórkowe β-agarazy, podczas gdy szczep P. agarolyticus wytwarza zarówno α -, jak i β-agarazę.

do innych bakterii wykazujących aktywność biologiczną wobec roślin morskich należą P. szczepy bakteriolytica, które zostały wyizolowane z brązowej algi Laminaria japonica i uważa się, że są czynnikiem sprawczym choroby czerwonej plamki u L. japonica. Stwierdzono również, że te Izolaty bakteryjne mają działanie bakteriolityczne zarówno wobec bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych. Biorąc pod uwagę korzyści, jakie aktywność bakteriolityczna zapewnia szczepom produkcyjnym poprzez uwalnianie związków odżywczych, jest to najprawdopodobniej istotna cecha dla bakterii żyjących w środowiskach oligotroficznych. Działanie bakteriolityczne może również przynieść korzyści szczepowi produkcyjnemu w konkurencji o przestrzeń w środowisku morskim.

zaproponowano przewagę konkurencyjną dla szczepów bakterii Pseudoalteromonas i Alteromonas w pozyskiwaniu i kolonizacji nutritrient dla ich działania algicydowego przeciwko fitoplanktonowi . W tym przypadku znaczenie ekologiczne działania algobójczego może mieć również kontrola sukcesji fitoplanktonu w środowisku morskim, jak wykazano w przypadku Pseudoalteromonas Sp. szczep Y przeciwko zakwitom szkodliwych mikro alg . Wykazano, że bakteria ta powoduje szybką lizę komórek i śmierć gatunków z rodzajów Chatonella, Gymnodinium i Heterosigma. Bakteria Pseudoalteromonas Sp. A28 wykazano również lyse alg morskich . Aktywnymi składnikami były proteazy i zasugerowano, że ekspresja proteazy jest regulowana przez acylowany system regulacyjny laktonu homoseryny .

wykazano również, że kilka innych gatunków Pseudoalteromonas wytwarza toksyny zewnątrzkomórkowe (patrz Tabela 1). Należą do nich P. tetraodonis, który produkuje neurotoksynę, tetradotoksynę, czynnik sprawczy zatrucia maskonura, i P. piscicidia, który uwalnia toksyny sugerowane powodować śmiertelność ryb . Ponadto wykazano, że komórki Pseudoalteromonas tunicata są toksyczne dla larw bezkręgowców i zarodników glonów, a P. denitrificans wytwarza substancje autotoksyczne, które zabijają komórki bakteryjne i hamują dalszy wzrost w gęstej hodowli . Wytwarzanie związków toksycznych może pozwolić bakteriom na kontrolowanie procesów na dużą skalę, w przeciwieństwie do bardziej ograniczonych modyfikacji ich mikro mieszkań spowodowanych przez specyficzne nietoksyczne czynniki zewnątrzkomórkowe.

3.3 polisacharydy zewnątrzkomórkowe

zakres aktywności biologicznej omówiony powyżej sugeruje, że ekspresja bakteryjnych związków zewnątrzkomórkowych pozwala producentowi skutecznie konkurować z innymi organizmami. Jednak bakterie mogą również wytwarzać związki, które pomagają w przetrwaniu innych organizmów morskich. Na przykład wykazano, że produkcja egzopolisacharydów (EPS) zwiększa szanse przetrwania innych organizmów w określonych siedliskach morskich. Mimo to efekty EPS zostały szczegółowo zbadane tylko w kilku przypadkach.

szczepy bakterii wytwarzające EPS są powszechne w obrębie rodzajów Pseudoalteromonas i Alteromonas. Co ciekawe, Alteromonas Sp. szczep HYD-1545, wyizolowany z robaków rurkowych, wytwarza EPS zawierający kwaśne cukry, które, jak wykazano, mają właściwości wiążące metale ciężkie. Sugeruje się, że bakteria jest ważna dla przetrwania organizmu gospodarza, który żyje w środowisku, w którym ekspozycja na chemikalia (np. siarczki metali) jest wysoka .

wykazano dalszy korzystny wpływ produkcji EPS przez bakterie na organizmy dla osadnictwa larw bezkręgowców . Na przykład Pseudoalteromonas Sp. szczep S9 wytwarza EPS zarówno w ciekłej hodowli, jak i na powierzchniach podczas stacjonarnej fazy wzrostu . Mutant typu dzikiego i Mutant generowany przez transpozon z niedoborem uwalniania EPS testowano przeciwko osadzaniu się larw tunikatu i wykazano, że Mutant typu dzikiego powodował wyższy stopień osadnictwa larw oraz późniejszą metamorfozę i rozwój w porównaniu z mutantem szczepu.

rola produkcji EPS przez Pseudoalteromonas Sp. szczep S9 w procesie przyłączania komórek bakteryjnych badano szczegółowo . Wrangstadh et al. wykazano, że wzrost produkcji EPS w warunkach głodu korelował ze zmniejszeniem hydrofobowości powierzchni komórek i adhezji komórek do powierzchni nieożywionych. Wzrost ilości EPS na powierzchni komórki bakteryjnej dodatkowo korelował ze wzrostem odwarstwienia komórek . Odpowiedzi te zostały wywołane głodem i postulowano, aby pomóc komórkom w ucieczce ze środowisk zubożonych w składniki odżywcze. Po oddzieleniu, wolne żywe komórki bakteryjne mogą „szukać” innych powierzchni do kolonizacji, które mogą zapewnić bardziej odpowiednie warunki do ich proliferacji.

wydaje się, że bakteryjne EPSs mogą służyć jako składniki antybakteryjne, kontrolować przywiązanie bakterii i korzystać z przetrwania zarówno gospodarza, jak i innych organizmów żyjących w pobliżu szczepu producenta . Ponadto EPSs może działać jako bariery ochronne przed antybiotykami, przed drapieżnictwem przez pierwotniaki, działać jako wzmacniacze pobierania składników odżywczych i zmniejszać dyfuzję niektórych substancji do iz komórek . Wiele gatunków Pseudoalteromonas stosuje produkcję EPS i jest prawdopodobne, że ta cecha zapewnia szereg strategii przetrwania dla komórek.

3.4 aktywność biologiczna wyrażona przez P. tunicata

dobrze przebadaną bakterią w obrębie rodzaju Pseudoalteromonas jest P. Tunicata (wcześniej oznaczona jako D2). Szczep ten został wyizolowany w wodach przybrzeżnych Szwecji z powierzchni dorosłego tunikatu zebranego na głębokości 10 m . Późniejsze badania wykazały, że szczepy podobne do P. tunicata występują na zielonej aldze Ulva lactuca w wodach australijskich . P. tunicata jest ciemnozieloną bakterią i stwierdzono, że wytwarza co najmniej pięć zewnątrzkomórkowych związków, które hamują inne organizmy przed osiedleniem się w społeczności bioosadowej (Fig. 2). Związki te hamują zasiedlanie larw bezkręgowców i zarodników glonów, rozwój bakterii i grzybów oraz kolonizację powierzchniową przez okrzemki . Składnik anty-larwalny jest stabilną Cieplnie cząsteczką polarną o wielkości mniejszej niż 500 Da . Cząsteczka antybakteryjna to nowe duże białko (190 kDa), które składa się z co najmniej dwóch podjednostek (80 i 60 kDa wielkości). Białko hamuje wzrost większości bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich izolowanych zarówno ze środowisk morskich, jak i lądowych . Komórki P. tunicata również wykazują autohamację, a komórki w wykładniczej fazie wzrostu są wrażliwe na to białko. Jednak gdy komórki osiągają fazę stacjonarną, która jest stanem fizjologicznym, w którym wytwarzane jest białko, stają się odporne. Ekologiczna rola tego antybakteryjnego białka w kolonizacji powierzchni P. tunicata jest obecnie badana przy użyciu szczepów zmutowanych w genach podjednostek. Składnik anty-sport jest peptydem o wielkości około 3 kDa . Ostatnie badania wskazują, że cząsteczka przeciwgrzybicza może być komórkową pochodną długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (niepublikowane dane). Związek przeciw okrzemkowy nie został jeszcze scharakteryzowany.

unikalne cechy P. tunicata dotyczą różnorodności wytwarzanych związków przeciwporostowych i hamujących oraz faktu, że wykazano, że każdy metabolit jest ukierunkowany na określone grupy organizmów (Fig. 2). Zjawisko to nie zostało zgłoszone w przypadku innych bakterii i może sugerować, że bakterie wykazujące takie cechy nie są powszechne w środowisku morskim, chociaż P. szczepy tunicata zostały wyizolowane z powierzchni organizmów wyższych zarówno w wodach zachodniego wybrzeża Szwecji, jak i w okolicach Sydney. Jednak niedostatek doniesień dotyczących takich bakterii i cech może odzwierciedlać fakt, że laboratoria na ogół nie mają dostępu do szerokiego zakresu testów biologicznych.

4 kontrola biologiczna i komercyjne zastosowanie gatunków Pseudoalteromonas

Biocontrol opiera się na antagonistycznych interakcjach między mikroorganizmami oraz między bakteriami a organizmami wyższymi. Sposób działania może być nietoksyczny i specyficzny, jak wykazują bakterie biofilmu, które odpychają zanieczyszczone makroorganizmy. Częściej jednak biokontrola drobnoustrojów opiera się na toksyczności, jak to zwykle ma miejsce w przypadku zwalczania organizmów wywołujących choroby drobnoustrojów. Biorąc pod uwagę, że gatunki Pseudoalteromonas wykazują szeroki zakres aktywności biologicznej, zaproponowano, że rodzaj ten obejmuje cenne szczepy biocontrol do stosowania w akwakulturze, technologiach przeciwporostowych i kontroli toksycznych zakwitów glonów. W rzeczywistości propozycje te zostały zbadane w niektórych programach badawczych. Autorzy tego minireview opracowali metodę unieruchomienia komórek P. tunicata w żele poliakrylamidowe i żele poliwinyloalkoholowe . Metoda została zastosowana w celu utrzymania komórek uwięzionych i żywych w powłoce powierzchni matrycy żelowej, co pozwoliło na wydostanie się składników przeciwporostowych. Żywotne, unieruchomione komórki wykazano po ponad 2 miesiącach w wodach morskich w laboratorium . Taka koncepcja „żywej farby” może stanowić nowatorską, przyjazną dla środowiska alternatywę dla obecnych toksycznych morskich substancji przeciwporostowych.

metody stosowane w celu zmniejszenia liczby drobnoustrojów chorobotwórczych podczas hodowli ryb, abalonu, ostryg i innych organizmów obejmują filtrację wody, ozonowanie, ekspozycję na światło ultrafioletowe i stosowanie sztucznej żywności zawierającej antybiotyki. Jednak żadna z tych metod nie okazała się skuteczna w zwalczaniu chorób mikrobiologicznych i istnieje oczywista potrzeba wprowadzenia alternatywnych metod. Maeda i in. zbadano zastosowanie antybakteryjnego szczepu Pseudoalteromonas undina jako środka biokontroli i wykazano, że organizm ten skutecznie hamuje wzrost szkodliwych bakterii i wirusów oraz poprawia wzrost ryb i skorupiaków hodowlanych. Ponadto, zdolność wielu gatunków Pseudoalteromonas do degradacji polimerów i przylegania do powierzchni została zastosowana w degradacji liofilizowanych liści Ulva dla diety wylęgarni larw Artemia nauplii . Wykazano, że dodanie Pseudoalteromonas espejiana do liści zwiększyło ich konwersję do form podobnych do mikroalg. Cząsteczki te zawierały również dwukrotnie większą ilość białka w wyniku biofilmu bakteryjnego w porównaniu z cząsteczkami, które poddano obróbce w sterylnych warunkach . Technologia ta może mieć zastosowanie w innych procesach wytwarzania pokarmu dla zwierząt.

5 kontrola zanieczyszczeń przez Gatunki Pseudoalteromonas w środowisku morskim

w odpowiedzi na różne metabolity lub inne bodźce środowiskowe komórki bakteryjne mogą wytwarzać związki chemiczne, które przynoszą korzyści szczepowi wytwórcy i/lub organizmowi gospodarza w ich ustanowieniu w odpowiednich siedliskach morskich. Przykłady obejmują przypadki, w których organizmy żywicielskie mogą wykorzystywać związki wytworzone bakteryjnie do własnej ochrony chemicznej przed organizmami zanieczyszczającymi, jak w przypadku alg zielonych Ulva lactuca i Enteromorpha intestinalis oraz osłonicy ciona intestinalis. Wiadomo, że organizmy te nie wytwarzają żadnych wtórnych metabolitów w celu ochrony przed zanieczyszczeniami, ale donoszono, że przenoszą przeciwporostowe gatunki Pseudoalteromonas . Stawiamy hipotezę, że ich powodzenie w pozostaniu nieuszkodzonym w terenie jest spowodowane powiązanymi bakteriami przeciwporostowymi.

podziękowania

badania w autorskim laboratorium zostały sfinansowane przez Australijską Radę ds. badań naukowych, stypendium doktoranckie na Uniwersytecie Nowej Południowej Walii dla C. H. oraz przez Centre for Marine Bioouling and Bio-Innovation przy UNSW. Chcielibyśmy podziękować Sally James, Suhelen Egan, Ashley Franks, Torsten Thomas i Harriet Baillie za pomoc i cenne dyskusje.